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详解重组卵白表达系统之昆虫杆状病毒表达系统

2022-10-22 分享

       目前常用的四大重组卵白表达系统划分有:原核细胞表达系统(主要以大肠杆菌为主),昆虫杆状病毒表达系统,酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

       本篇文章着重介绍一下昆虫杆状病毒表达系统。昆虫杆状病毒表达系统具有宁静性好、重组卵白表达量高、重组卵白翻译后修饰完整、易实现大规模低本钱生产等特点,因而获得了广泛的应用。

       昆虫杆状病毒表达系统 (baculovirus expression vector system, BEVS) 是以昆虫杆状病毒作为外源基因载体, 昆虫和昆虫细胞作为受体的表达系统。昆虫杆状病毒表达系统与其他表达系统相比有其奇特的优势:

√ 昆虫细胞与哺乳动物细胞对重组卵白的翻译及翻译后修饰的模式和能力相似(包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和剖析等),表达出的重组卵白的生物活性(抗原性、免疫原性和功效等)与天然卵白相似;
√ 杆状病毒基因具有较强的柔韧性,能容纳较大片段的外源DNA插入;
√ 昆虫细胞可进行悬浮培养,且容易在无血清培养基中存活,容易实现大规模低本钱生产。


       基于以上原因昆虫杆状病毒表达系统日益受到人们的重视并广泛应用于科研及工业生产中。但最常用的杆状病毒AcMNPV的基因组较大,达134kb,目的基因导入AcMNPV难以通过通例分子克隆手段实现。目前市面上常用解决该问题的技术手段主要涉及3种,包括:在昆虫细胞中的同源重组、在大肠杆菌中以转座子介导的重组以及目的基因体外重组到病毒基因组


图一 重组杆状病毒构建示意图


一、昆虫细胞中的同源重组

       在昆虫细胞中通过供体质粒与AcMNPV上的同源臂实现重组是研究人员最早使用的要领。


       最初人们将完整的环状AcMNPV与带有目的基因的供体质粒共转染昆虫细胞,通过空斑筛选的方法挑选出重组后的子代病毒,但该要领获得重组病毒概率极低(<2%),并且空斑筛选耗时耗力,对操作人员的技术和经验都有较高的要求。


       随后人们发明AcMNPV中不保存Bsu36I酶切位点,通过引入一个或多个Bsu36I酶切位点将AcMNPV线性化后,获得重组病毒的概率大大提高(~30%)。另外,ORF1629被发明是病毒复制的必须元件,将病毒基因中的ORF1629截断,在供体质粒中插入缺陷ORF1629组分,通过重组与AcMNPV上缺陷的ORF1629互补能进一步提高重组概率(~90%),BacPAK、BaculoGold、BestBac等商业化BEVS正是基于此原理。


       由于线性化历程亲代AcMNPV仍有残留,需要空斑筛选对病毒进行纯化。虽然各公司宣称对病毒进行纯化是可选操作,但亲代病毒残留会在差别水平上对目的卵白的表达造成影响。Bac-n-Blue在此基础上通过将LacZ整合到AcMNPV,重组后开启LacZ表达,借助蓝白斑筛选实现对阳性病毒的筛选,从而免除空斑筛选这一历程,但仍需要对病毒进行纯化。FlashBAC则是将一段细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)导入AcMNPV,付与其在大肠杆菌中扩增的能力,又因FlashBAC上缺陷的ORF1629,使未重组的亲代病毒无法复制,可以免去AcMNPV线性化和空斑筛选的办法。



图二 BacPAKTM杆状病毒表达系统


二、大肠杆菌中转座子介导的重组

       该系统中的病毒基因组经过革新后(称为杆状病毒穿梭载体Bacmid),能够在大肠杆菌如DH10Bac菌株中复制,通过供体质粒中目的基因的两侧锚有Tn7转座原件,借助DH10Bac菌株中helper质粒编码的转座酶活性,将目的基因转座到bacmid特定位点上,目的基因的插入会导致bacmid上的LacZ基因爆发移码,进而通过蓝白斑筛选鉴定出阳性重组bacmid,提取后转染昆虫细胞。


       该要领的优点是蓝白班筛选结合后续的PCR鉴定手段稳定性好,阳性率接近100%,基于此类的BEVS有Bac-to-Bac、MultBac等。



图三 Bac-to-Bac®系统示意图


三、体外重组

       目的基因体外重组到病毒基因组的商业化系统比较少,市场上常见的是Invitrogen公司开发的BaculoDirect系统。该系统结合了Gateway克隆技术,将attR序列整合到线性化的杆状病毒基因组中,而供体质粒上目的基因两侧带有attL序列。只需简单地将开端克隆与BaculoDirect线性DNA和Gateway LR Clonase酶进行混淆,室温孵育1小时,之后转染至Sf9或Sf21昆虫细胞即可进行重组病毒的制备。该系统的优点是便当快速,但缺点显而易见,需要实验室配套Gateway克隆生态,本钱较高。



四 BaculoDirect?系统卵白表达历程


       目前商业化的BEVS系统琳琅满目,但都是基于以上3种技术路线将目的基因整合到昆虫杆状病毒以获取目的卵白。实验者应在时效性,准确率和本钱之间做出权衡,选择最适合自己需求的昆虫杆状病毒表达系统。


参考文献:

[1] S. N. Beljelarskaya. Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Mol Biol. 2011;45(1):123-138.

[2] https://www.takarabio.com/

[3] https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10359016?SID=srch-srp-10359016

[4] https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12562039?SID=srch-srp-12562039 


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